Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y

    Publicación original: Arch. med. vet., 1997, vol. 29, no.2, p.283-294. ISSN 0301-732X.
    Reproducción autorizada por: Revista Archivos de Medicina Veterinaria ffredes[arroba]abello.dic.uchile.cl

    RESUMEN: La fasciolosis causada por Fasciolahepatica se diagnostica rutinariamente mediante el examen coprológico.Debido a que este examen no es 100% sensible y además es ineficaz en la etapapre-patente, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar yseleccionar fracciones antigénicas de valor diagnóstico de extractos deexcreción-secreción del parásito.

    Se utilizó cromatografía deexclusión por tamaño molecular (Sephacryl S-300), electroforesis en geles depoliacrilamida en ambiente reductor (SDS-PAGE) y posterior western blot (WB),además de un método de "enzyme-linked immuno-sor-bent assay" (ELISA)en microplaca. Para evaluar el valor diagnóstico de los antígenos se usaronsueros de las especies ovina, porcina y equina en tres estados (sanos, conotras parasitosis y naturalmente infectados con F. hepatica).

    Mediante el métodocromatográfico se obtuvieron hasta 5 "peaks", que interpolados en unacurva patrón representaron polipéptidos de pesos aproximados de 2.000, 400,150, 29 y menores a 29 kDa. De éstos, los inmunorreactivos específicos para laenfermedad en las tres especies , bajo los criterios de SDS-PAGE yposterior WB, fueron los de 400, 150, 29 y <29.

    La evaluación medianteELISA en microplaca, de estas fracciones con los sueros de las tres especiesanimales infectadas, indicó que la fracción de 29 kDa ofreció valores desensibilidad y especificidad de 94.5% y 93.5%, respectivamente. Similaresvalores de sensibilidad y especificidad se determinaron al enfrentar estafracción antigénica con sueros de ovinos en la etapa prepatente de lainfección. Esta misma fracción analizada por el criterio de SDS-PAGE y luegopor WB dio dos bandas de reconocimiento específico, una de 29 kDa y otra de 14kDa aproximados. Con estos resultados concluimos que la fracción cromatográficade 29 kDa sería capaz de discriminar en las especies ovina, porcina y equina,entre aquellos sanos, con otras parasitosis y con fasciolosis. Ademásfue también eficiente para diagnosticar la infección en etapa prepatente enovinos. Por ello se constituye en una fracción promisoria para ser purificada yempleada en estudios epidemiológicos mediante ELISA.

    Palabras claves: fasciolosis, diagnóstico,SDS-PAGE, Western Blot, ELISA.

    SUMMARY: Diagnostic evaluation ofchromatographic fractions of Fasciola hepatica by Western Blot and ELISAin infected animals

    The antigenic components ofexcretory-secretory products of adult F. hepatica, were separated by gelfiltration chromatography (Sephacryl S-300) and then analized by polyacrylamidegel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western Blot (WB). In order toevaluate the sensitivity, specificity and predictive value of the selectedfractions an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used with sera fromsheep, swine and horses infected with F. hepatica, as well as with control sera(uninfected animals).

    The chromatographic curvepresented up to 5 peaks, representing polypeptides with a molecular weight of2000, 400, 150, 29 and less than 29 kDa, according to the interpolation with astandard curve of commercial polypeptide molecular weights. The resultsobtained with SDS-PAGE and WB using sera from the three species, indicated thatthose fractions of 400, 150, 29 and <29 kDa contained polypeptides,specifically recognized only by infected animals. When these fractions wereevaluated with sheep, horse and swine sera by means of ELISA, the most efficientfraction was the 29 kDa, exhibiting an average sensitivity and specificity of94.5% and 93.5%, respectively in the three species. The SDS-PAGE and WB assayof this fraction showed the presence of two immunoreactive bands, a 29 kDa andanother of 14 kDa.

    According to these results,it is concluded that the polypeptides contained in the 29 kDa chromatographicfraction would be suitable specific antigens, since they discriminate betweeninfected and non infected F. hepatica animals. This fraction was also efficientin diagnosing fasciolosis in the prepatent stage of the infection in sheep.Therefore this fraction should be further studied and purified as itconstitutes a prominent immunodiagnostic fraction which may be used for massscreening studies of fasciolosis using an ELISA test.

    Key words: fasciolosis, diagnosis, SDS-PAGE,Western Blot, ELISA.

    INTRODUCCION

    La fasciolosis en Chile hadesplazado a la hidatidosis como la zoonosis de mayor prevalencia en losanimales de abasto beneficiados en los mataderos controlados por los serviciosde salud. Su agente etiológico, Fasciola hepatica, es el único tremátodode importancia médico- y de salud pública en nuestro país.

    La infección por elparásito se presenta a lo largo de todo el territorio nacional, con la solaexcepción de la XII Región. Las zonas más afectadas son las ubicadas entre laIV y X Regiones (Chile, 1989).

    La mayor importancia deesta parasitosis radica fundamentalmente en que reduce la productividad de losanimales. Así por ejemplo, se ha estimado que un animal puede producir menoscarne debido a que consume en promedio un 15% menos de alimento (Ferre y col.,1994).

    El examen coprológico seutiliza rutinariamen- te en los como método diagnóstico, sin embargo,no logra detectar el 100% de los casos infectados (Gorman y col., 1991).Además, no es útil para diagnosticar la etapa prepatente de la infección (faseaguda), ya que los parásitos por ser inmaduros no producen huevos (Zimmerman ycol., 1982). Otro procedimiento diagnóstico, pero inespecífico, es la mediciónde enzimas celulares tales como son la transaminasa glutámica oxalacética, laaspartato aminotransferasa y la sorbitol dehidrogenasa, cuyos niveles aumentanen el período prepatente de la infección, pudiendo dar una evidenciacircunstancial y no específica sobre la presencia de F. hepatica (Sykesy col., 1980; Hawkins, 1984; Ferre y col., 1994). También se ha descrito comoprocedimiento diagnóstico inespecífico la medición de la respuesta inmunecelular expresada por una eosinofilia periférica (Hillyer, 1993). Al respectose ha descrito que la proteína básica mayor, derivada de eosinófilos, tiene invitro un elevado efecto destructor de fasciolas (Meeusen y col., 1995).

    Investigaciones recientesen busca de alternativas diagnósticas más eficientes y de aplicación a granescala han demostrado que con las técnicas inmunológicas se puede realizar undiagnóstico temprano de la parasitosis.

    Esto tiene el beneficio depermitir adelantar las medidas de control a fechas oportunas para evitar quelos parásitos puedan contaminar los hábitats de los caracoles huéspedesintermediarios con sus huevos.

    La prueba de ELISA es laque ha probado ser la más eficiente en el diagnóstico de las infecciones por F.hepatica. Sin embargo, si se lograra purificar de los extractos antigénicosaquellas fracciones de mayor sensibilidad y especificidad contra las formasmaduras e inmaduras del parásito, esta eficiencia aumentaría aún más (Gorman ycol., 1991).

    Un método que se ha usadobastante en investigación y para confirmar el resultado de una prueba de ELISAes la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y su posteriorWestern Blot (WB) (Tsang y col., 1983; Margni y Malchiodi, 1989). MedianteSDS-PAGE y posterior WB se han identificado polipéptidos de bajo peso molecularque son sensibles y específicos para F. hepatica.

    En el presente trabajo se pretende continuar con la caracterización antigénica de este parásito, semipurificando aquellos polipéptidos que han demostrado ser inmunológicamente relevantes (Gorman y col., 1991), para luego mediante ELISA evaluar el comportamiento de ellos en infectados.  




    MATERIAL Y METODOS

    Antígenos (Ag). Se obtuvieron fraccionesantigénicas de productos de excreción-secreción (E-S) de fasciolas adultasrecuperadas desde el hígado de beneficiados en un matadero de laRegión Metropolitana.

    Para ello, las fasciolasvivas recolectadas fueron lavadas en suero fisiológico estéril y luegoincubadas durante 16-18 h a 37° C, en solución Hedon-Fleig estéril (Morilla yBautista, 1986). El sobrenadante fue dializado en agitación contra aguadesionizada, durante 24 h a 4° C, luego fue sometido a ultracentrifugación(15.000 x g por 20 minutos) y liofilización hasta un volumen de 1 ml. Elsobrenadante fue almacenado en alícuotas, a -70° C, previa determinación de laconcentración proteica (Bradford, 1976).

    Cromatografía. El extracto E-S fuesemipuri-ficado por fraccionamiento cromatográfico de exclusión por tamañomolecular o filtración en geles (Stites y Terr, 1991).

    Se cargaron 5 ml del Ag E-S(4 µg/µl de proteína) previamente filtrados a través de membrana denitrocelulosa (poro 0.45 µm), en una columna de Sephacryl S-300 (Sigma), de 2.5cm de diámetro y 90 cm de largo, cuya fase líquida fue buffer PBS 0.01 M conazida 0.03% p/v (pH: 7.4). La detección fue a 280 nm en un detector de flujocontinuo (Pharmacia). Las fracciones fueron colectadas en un colectorautomático (Pharmacia) e inmediatamente liofilizadas hasta obtener un volumenfinal aproximado de 500 µl al cual se le agregaron 500 µl de una mezcla deinhibidores enzimáticos.

    Se obtuvo, además, unacurva cromatográfica patrón con polipéptidos comerciales cuyos pesosmoleculares (PM) oscilaron entre los 2.000.000 a los 29.000 (azul dextrano2.000 kDa; tiroglobu-lina bovina 669 kDa; apoferritina esplénica equina 443kDa; alcohol dehidrogenasa 150 kDa; albúmina sérica bovina 66 kDa y anhidrasacarbónica 29 kDa), en un tiempo de corrida inferior a las 24 h desde que secargó la muestra. De esta manera se obtuvo una estimación del PM de lospolipép-tidos constituyentes del preparado antigénico en su forma nativa.

    Análisis de fraccionescromatográficas. Seanalizó la curva cromatográfica y las fracciones colectadas, correspondientes alos "peaks" con más alta absorbancia, mediante SDS-PAGE y suposterior WB. Se emplearon sueros de infectados y no infectados con F.hepatica, agrupados en "pools" de 10 muestras cada uno. Los suerosdetectores fueron de ovinos sin F. hepatica, ovinos infectados naturalmente,ovinos sin F. hepatica, pero con quistes hidatídicos o Thysanosomaactinioides, equinos sin F. hepatica, equinos infectados naturalmente,porcinos sin F. hepatica, porcinos infectados naturalmente y porcinossin F. hepatica, pero con Cysticercus cellulosae.

    La infección natural de losovinos se realizó trasladando corderos procedentes de la Estación ExperimentalHidango del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA delMinisterio de Agricultura) a un predio de la VII Región, donde la fasciolosises endémica (Alcaíno y col., 1992). Luego ellos fueron transportados adependencias de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de laUniversidad de Chile, para su estudio. Mediante exámenes coprológicos seestableció la patencia de la infección.

    SDS-PAGE y WB. La técnica se realizó enmini-geles (8 x 7 x 1.5 mm) a una concentración de 12%, en una cámara vertical(Mini-Protean II, BIO-RAD), en condición denaturante, con peineta discontinua ya una diferencia de potencial de 100 V (Tsang y col., 1983). En el carrilcentral se incluyó un peso molecular comercial estándar, con un rango de 14.2 a66 kDa, mientras que en los otros carriles se colocaron los diferentes eluidosseleccionados. Algunos de los geles fueron teñidos con azul de Coomassie oplata y otros fueron electrotransferidos.

    Los polipéptidos separadospor peso molecular fueron transferidos a 100 V por 90 minutos, a 4° C, amembranas de nitrocelulosa. Estas fueron incubadas con los sueros detectores,diluidos 1:100 en PBS-Tween 20, posteriormente se incubaron en una soluciónconteniendo el conjugado anti-IgG antiespecie específica, marcadas conperoxidasa (Sigma) y PBS-Tween 20 según titulación previa. Luego fueronreveladas con el sustrato (diaminobenzidina, PBS y H2O2). Una vez aparecidaslas bandas, las membranas se lavaron en agua destilada. El WB permitió laidentificación y separación de aquellas fracciones cromatográficas conteniendolos polipéptidos considerados relevantes desde el punto de vista diagnósticopara cada especie animal.

    Aplicación de la pruebade ELISA. Se empleóuna técnica de ELISA en microplaca, para evaluar la eficiencia diagnóstica delas fracciones así seleccionadas. Para ello se usaron sueros individuales deanimales infectados y no infectados con F. hepatica distribuidos ensueros de 10 ovinos con fasciolosis en etapa prepatente, 37 ovinos confasciolosis en etapa crónica, 35 ovinos sin infección, 40 equinos confasciolosis crónica, 40 equinos sin infección, 40 porcinos con fasciolosiscrónica y 40 porcinos sin infección.

    Los sueros de ovinos,porcinos y equinos sin infección con F. hepatica fueron obtenidos deanimales de la XII Región y de mataderos de la Región Metropolitana que alexamen post mortem no demostraron la infección.

    Los sueros de ovinos conquistes hidatídicos o infectados con T. actinioides pero sin infección con F.hepatica también se obtuvieron de de la XII Región, mientras que lossueros de los cerdos infectados con C. cellulosae se obtuvieron demataderos de la Región Metropolitana previa inspección post mortem, parademostrar la ausencia de fasciolas. Los sueros de ovinos en fase prepatente dela infección se obtuvieron de 10 corderos naturalmente infectados. Los suerosen fase patente o con infección crónica, de las diferentes especies ,provenían de de matadero, en que mediante examen post mortem severificó la presencia de la infección. Se utilizaron como controles negativosun "pool" de sueros de de la XII Región y como controlespositivos, un "pool" de sueros de las diferentes especies animalescon infección crónica.

    La prueba de ELISA serealizó en microplacas de fondo plano de 96 pocillos (12 x 8). Previatitulación en duplicado de cada una de las diferentes fracciones antigénicas,de los sueros y del conjugado, se seleccionaron sólo aquellas fracciones quedemostraron discriminación entre las densidades ópticas (PO) de los controlesnegativos y los controles positivos.

    Con cada fraccióncromatográfica seleccionada se sensibilizaron dos placas de poliestireno porespecie animal. Estas fueron diluidas en una solución tampón (pH: 9.6) paralograr una concentración proteica de 4 µg/ml. Siempre se dejó en la mismaubicación un pocillo vacío como blanco. Luego las placas se lavaron y sebloquearon con leche descremada al 3% en PBS-T20 0.05% v/v, se sellaron y semantuvieron en congelación (-70° C) hasta su uso.

    Todos los sueros en estudiose diluyeron (1/64) en una solución de leche descremada al 3% en PBS-T20 0.05%v/v y se agregaron 100 µl a cada pocillo en duplicado. Las placas se incubaronpor una hora a 37° C en cámara húmeda. Luego se lavaron, se incubaron con 100µl de una anti-IgG peroxidasa especie específica, diluida al 1/4000 en PBS-T200.05% v/v, por una hora a 37° C en cámara húmeda. Luego se lavaron y en cadapocillo se agregaron 100 µl del sustrato ortofenilendiamina, buffer citrato,H2O2 y se incubaron por 10 a 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Lareacción enzimática se detuvo adicionando a cada pocillo 25 µl de H2SO4 0.25 M.La lectura de cada placa se realizó a 492 nm con un lector automático de ELISA(BDSL Imunoskan Plus).

    El criterio que se empleópara interpretar el resultado de las lecturas fue uno de los indicados porVoller y col. (1979), en que se considera positivo a aquel suero que ofrece unadensidad óptica (DO) superior o igual a dos veces la lectura promedio de lossueros controles negativos. Cada placa incluyó 3 controles negativos enduplicado. Este criterio entregó un valor "cut off" para cada placa.Se analizaron y compararon los resultados obtenidos por ELISA y el examen postmortem mediante la prueba de Mc Nemar para proporciones correlacionadas odependientes (Remington y Schork, 1970).

    El análisis de losresultados permitió establecer la sensibilidad y especificidad de lasfracciones seleccionadas, así como los correspondientes valores predictivospositivo y negativo, para una proyección práctica en un diagnósticoinmunológico de rutina (ELISA) de las infecciones naturales con F. hepatica. 

    RESULTADOS Y DISCUSION

    Al analizar los resultadosde este estudio, encaminado a la selección y caracterización de antígenos derelevancia diagnóstica, se corroboró la alta complejidad proteica y antigénicade F. hepatica (Gorman y col., 1992). Sin embargo, esta complejidadinfluye en forma negativa en el rendimiento de las pruebas inmunodiagnósticas,por las reacciones cruzadas o inespecíficas generadas por los determinantesantigénicos compartidos con otras parasitosis (Gorman y col., 1994, 1995). Espor ello que la separación y purificación de estos antígenos parasitarios surgecomo necesaria para aumentar los valores de sensibilidad y especificidad de laspruebas diagnósticas.

    El método cromatográfico deexclusión por tamaño molecular y el tipo de relleno utilizado (Sephacryl S-300,con rango de fraccionamiento para proteínas globulares de 10.000 a 1.500.000),permitió diferenciar hasta 5 "peaks" medianamente resueltos, aunqueel último de ellos correspondió a péptidos muy pequeños (fig.1).

    Cuadro 1.
    Bandas de reconocimiento antigénico específico reconocidas por sueros de
    animales infectados mediante western blot empleando fracciones cromatográficas
    de productos de E-S de Fasciola hepatica.
    Specific bands recognized by infected animal sera tested by western blot with Fasciola
    hepatica chromatographic fractions of excretory-secretory products.

    Fracción

    Bandas específicas (kDa)

     cromatográfica

    Ovinos

    Equinos

    Porcinos

     2.000

    -

    -

    -

     400

    29

    -

    -

    150

    29

    -

    29

    29

    29 y 14

    29 y 14

    29 y 14

    <29

    29

    29 y 14

    29 y 14

    La interpolación con lacurva cromatográfica estándar permitió calcular aproximadamente los pesosmoleculares de aquellos polipéptidos obtenidos en los diferentes eluidoscromatográficos, correspondiendo a 2.000-400-150-29 y menores de 29 kDa, en suforma nativa (fig. 1). Este rango de valores concuerda con los obtenidos porZimmerman y Clark (1986), quienes también purificaron y fraccionaron antígenosde parásitos empleando un preparado antigénico E-S de F. hepatica ydiferentes métodos cromatográficos. Ellos usaron una columna Sephacryl S-200obteniendo hasta 4 "peaks" y con una columna de Superosa-6 (FPLC)obtuvieron 9 "peaks". Sin embargo, por el primer método, ellosdeterminaron pesos moleculares aproximados de 376.000, 202.000, 70.000 y 40.000respectivamente, valores que en sí difieren con los del presente estudio,probablemente debido a diferentes marcadores comerciales utilizados, así comoal tipo de columna empleada (Sephacryl S-200), la cual resuelve proteínasglobulares de 5.000 a 250.000. El quinto "peak" que describimos, porsu pequeño tamaño, puede corresponder sólo a péptidos de degradación delmaterial antigénico original. Esto se confirma al observar en la figura 2 elcorrespondiente análisis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de cada eluido,al encontrar sólo bandas que fueron arrastradas de la fracción anterior,fenómeno que ocurre cuando los "peaks" son medianamente resueltos.

    Estos mismos autores alemplear Dot-ELISA (una variación de ELISA que utiliza como soporte membranas denitrocelulosa) encontraron fracciones reaccionantes sólo en los eluidoscromatográficos del tercer y cuarto "peak", vale decir, en los 70 kDay 40 kDa. Así también Rivera y col. (1988) obtuvieron mediante HPLC unafracción muy abundante de 150-160 kDa y otra de 25-30 kDa, que adaptadas a unDot-ELISA resultaron ser detectadas por los sueros de conejos con fasciolosisaguda y crónica. Estos resultados son similares a los que describimos en esteestudio, analizando los eluidos del tercer y cuarto "peak", medianteWB y con los del cuarto "peak"evaluado mediante ELISA en microplacacon sueros de animales detectores.

    La evaluación de lasdiferentes fracciones cromatográficas mediante SDS-PAGE confirmó la presenciade varias bandas, la mayoría entre los 66 y 14 kDa (fig. 2), rango descrito poruna serie de investigadores (Zimmerman y Clark, 1986; Santiago y Hillyer, 1988;Hillyer y col., 1988; Sexton y col., 1990; Hillyer, 1993; Ruiz-Navarrete ycol., 1993; Gorman y col., 1994, 1995).

    Figura 1. Separación de los polipéptidoscomerciales (Pm st) y de antígenos E-S de F. hepatica (Ag E-S) mediantecromatografía de exclusión por tamaño molecular.
    Sephacryl S-300 separation of F. hepatica E-S antigens (Ag E-S) and molecularweight standards.

    Figura 2. SDS-PAGE de las fraccionescromatográficas de antígenos E-S de F. hepatica, teñidas con plata (a: 2000, b:400, c: 150, d: 29, e: <29; PM: peso molecular estándar).
    SDS-PAGE of chromatographic F. hepatica E-S fractions stained with silver (a:2000, b: 400, c: 150, d: 29, e: <29; PM: weight markers).

    Así también, al utilizarlos sueros detectores de animales infectados y no infectados con F. hepatica,junto con los sueros de animales con otras parasitosis (hidatidosis o Thysanosomaactinioides en ovinos y Cysticercus cellulosae en porcinos), seconstató la presencia de aquellos polipéptidos de 14 y 29 kDa descritos comoespecíficos y sensibles, al ser reconocidos sólo por aquellos sueros de losanimales con fasciolosis (fig. 3).

    Cada fraccióncromatográfica, excepto la 2.000 kDa, presentó una o más de estas bandas. Enlas fracciones cromatográficas de 400 y 150 kDa se reconoció sólo la banda de29 kDa, hecho evidenciable en la especie ovina y porcina; mientras que en lasfracciones cromatográficas de 29 y <29 kDa se identificaron las bandas de 29y 14 kDa en las tres especies en estudio (cuadro 2).

    Cuadro 2.
    Sensibilidad, especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
    mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis ovina en fase prepatente.
    Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic fraction in the
    diagnosis of prepatent fasciolosis by ELISA in sheep.

    Fracción

    Sensibilidad

    Especificidad

    Valor predictivo

     

    %

    %

    (+)%

    ()%

     < 29 kDa

    60

    95

    75

    90

        29 kDa

    90

    90

    69

    97

      150 kDa

    90

    75

    47

    97

      400 kDa

    50

    90

    56

    88

    Figura 3. WB de la fracción cromatográficade 29 kDa, de antígenos E-S de F. hepatica, en ovinos (O), equinos (E) yporcinos (P).
    Carril 1: pool animales sin fasciolosis; carril 2: pool animales confasciolosis; carril 3: pool animales con otras parasitosis (hidatidosis oThysanosoma actinioides en ovinos y Cysticercus cellulosae en porcinos).
    WB of the 29 kDa chromatographic fraction of F. hepatica E-S antigens usingsheep (O), horse (E) and pig (P) sera.
    Lane 1: pool sera from non infected animals; lane 2: pool sera from fasciolosisinfected animals; lane 3: pool sera from animals with other parasiticinfections (hidatidosis or Thysanosoma actinioides in sheep and Cysticercuscellulosae in swine).

    La repetición de bandas enlas fracciones 29 y <29 kDa puede deberse a dos razones: es posible quecuando las diferentes proteínas nativas constitutivas de las fracciones sesometen a condiciones denaturantes, ellas originen moléculas de igual peso, quese sobreponen en una misma banda. O bien que al estar cada "peak"medianamente resuelto por un efecto de traslape de curvas y arrastre aparezcanlas mismas proteínas en alguna fracción pero en menor concentración. Por loanterior, conviene destacar que resultaron más concentradas las bandas de 29 y14 kDa en la fracción cromatográfica llamada 29 (fig 4).

    Figura 4. SDS-PAGE de la fraccióncromatográfica denominada 29, de antígenos E-S de F. hepatica, teñida con azulde Coomassie.
    SDS-PAGE of the 29 kDa chromatographic fraction of F. hepatica E-S antigensstained with Coomassie blue.

    Las bandas reconocidas porlos "pools" de sueros de las diferentes especies animales estudiadasy analizadas por WB se distribuyeron en los rangos de pesos moleculares depolipéptidos ya identificados por otros autores (fig. 3).

    Nuestra fraccióncromatográfica de 29 kDa, por su peso y origen, podría ser o estar muyrelacionada con polipéptidos que se han logrado purificar, caracterizar eincluso clonar y secuenciar el DNA de algunos de ellos. Tal es el caso de unacisteína proteinasa (CP) de 27 kDa que fue purificada de un homogeneizado defasciolas adultas y que ha sido clonada, secuenciada, evaluada y reconocidamediante ELISA usando sueros de humanos con fasciolosis (Yamasaki y Aoki, 1993;Heussler y Dobbelaere, 1994). Otro polipéptido descrito con reacción protectivacruzada entre los géneros parasitarios Fasciola y Schistosoma, quedetermina una respuesta inmune variada según la especie animal afectada, es laglutatión S-transferasa (GST) de 28 kDa, también proveniente de fasciolasadultas (Sexton y col., 1990; Hillyer y col., 1992a; Panaccio y col., 1992).

    Otro polipéptido que podríarelacionarse con el de 14 kDa reconocido, en este estudio, en forma específicamediante WB con los sueros de animales con fasciolosis fue aislado por Hillyery col. (1988), también de parásitos adultos, demostrando reacción cruzada,diagnóstica y protectiva frente a otro tremátodo no existente en Chile, Schistosomamansoni. Este ha sido caracterizado como una proteína unida a ácido graso("fatty acid binding pro-tein") de 12 kDa (Fh 12) de la cual inclusose ha llegado a producir la proteína recombinante designada rFh 15, por ser de15 kDa (Hillyer, 1995).

    Los estudios de Espino ycol. (1987) y los de Santiago y Hillyer (1988) ya habían demostrado la eficaciainmunodiagnóstica de la prueba de ELISA en la fasciolosis humana y animal,utilizando los productos de excreción-secreción de F. hepatica adulta comoantígeno. Así también, evaluando diversos métodos diagnósticos para lafasciolosis animal, entre ellos ELISA, empleando un macerado total del parásitoadulto, hemos logrado además detectar respuesta inmune en corderos infectadosmuy precozmente, al mes y medio p.i.

    Sin embargo la sensibilidadpor especie fue inferior a 65%. En cambio, la sensibilidad promedio de 94.5%,que ahora describimos al emplear ELISA con las fracciones mencionadas, seríamuy similar a los encontrados por Hillyer y col. (1992b), quienes llegaron a unnivel óptimo de sensibilidad de un 95%, usando FAST-ELISA en humanos. Noobstante, cabe hacer notar que en la especie humana la respuesta no es tancompleja, pues por lo general no se encuentran poliparasitados como losanimales, por lo que nuestros resultados en ellos cobran mayor importancia aún,ya que siendo portadores de otras parasitosis y sin fasciolosis no presentaronrespuesta inmune cruzada.

    En el presente estudio seestableció que en las tres especies animales la fracción cromatográfica de 29kDa correspondería, según los valores de sensibilidad, especificidad y valorespredictivos, la de mayor interés según lo detallan los cuadros 3, 4, 5 y 6. Conella fue incluso posible identificar a más del 90% de los ovinos infectados,sin importar en qué etapa de la infección se encontraran (prepatente opatente). Aún más, cabe destacar que la fracción cromatográfica de 150 kDatampoco presentó diferencias diagnósticas significativas, en las especies ovinay porcina, entre el examen post mortem y ELISA (p<0.05).

    Cuadro 3.
    Sensibilidad, especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
    mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis ovina en fase patente.
    Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic fraction in the
    diagnosis of patent fasciolosis by ELISA in sheep.

    Fracción

    Sensibilidad

    Especificidad

    Valor predictivo

     

    %

    %

    (+)%

    ()%

     < 29 kDa

    80

    95

    94

    83

        29 kDa

    95

    90

    90

    95

      150 kDa

    85

    75

    77

    83

      400 kDa

    18

    90

    64

    52

     

    Cuadro 4.
    Sensibilidad, especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
    mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis porcina.
    Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic fraction in the
    diagnosis of pig fasciolosis by ELISA.

    Fracción

    Sensibilidad

    Especificidad

    Valor predictivo

     

    %

    %

    (+)%

    ()%

     < 29 kDa

    68

      97

      96

    69

        29 kDa

    93

      97

      97

    91

      150 kDa

    98

    100

    100

    97

      400 kDa

      0

    100

        0

    43

     

    Cuadro 5
    Sensibilidad, especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
    mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis equina.
    Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic fraction in the
    diagnosis of horse fasciolosis by ELISA.

    Fracción

    Sensibilidad

    Especificidad

    Valor predictivo

     

    %

    %

    (+)%

    ()%

     < 29 kDa

      33

    100

    100

      58

        29 kDa

    100

      97

      98

    100

      150 kDa

      33

    100

    100

      58

      400 kDa

       8

    100

    100

      51

    Lo anterior demostraría quela fracción inmunogénica de 29 kDa sería conservada en el transcurso de lainfección. La mayor eficiencia de esta fracción corrobora que la pureza de losdeterminantes antigénicos en el rendimiento de esta prueba es esencial. No asícuando se emplea un extracto crudo del parásito, el cual presentaría unainfinidad de epitopos, algunos probablemente compartidos con otros vermes yotros que pueden ofrecer reacciones inespecíficas.

    Por otra parte, dado quelos valores predictivos positivos y negativos logrados en este estudio fueronmuy adecuados, se demuestra que la fracción cromatográfica de 150 kDa (enporcinos) y sobre todo la de 29 kDa en las tres especies animales, sonrelevantes en el inmunodiagnóstico de esta parasitosis. Esta conclusión se veaún más reforzada al no observar con estas fracciones diferencias diagnósticassignificativas (p <0.05) entre el examen post mortem y ELISA.

    Por los resultadospromisorios obtenidos, resulta interesante continuar con esta línea de investigaciónpara contribuir al desarrollo tecnológico y el control de importantesenfermedades parasitarias presentes en el país.

    AGRADECIMIENTOS

    Los autores desean expresarsus agradecimientos a: los Dres. Patricia Avalos, José Naranjo y RigofredoVeneros, Médicos Veterinarios del Servicio Agrícola y Ganadero, por facilitarlos sueros de animales de la XII Región.

    Al Departamento dePost-grado y Post-título de la Universidad de Chile, Beca N° 042-94.
    A FONDECYT Proyecto N° 194-0245.

    *  Financiado porDepto. de Post-Grado y Post-Título de la Universidad de Chile, Beca Nº 042-94,y FONDECYT Proyecto Nº 194-0245.

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    F. FREDES, M.V., M.Sc.,;T. GORMAN, M.V., M.P.V.M.; M. SILVA, T.M.; H. ALCAINO, M.V., Ph.D.
    Departamento deMedicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias,Universidad de Chile, Casilla 2, Correo 15, Santiago, Chile. Fax 56-2 5416840.
    ffredes[arroba]abello.dic.uchile.cl



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